猪白细胞介素6定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测猪血清、血浆或细胞培养上清液中的IL-6浓度

。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整, 如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏

。

猪IL-6简介：

白介素6（IL-6）是一类多功能的蛋白，在宿主防御



，急性期反应











，免疫反应

，造血功能

，神经系统等方面起到重要的作用。白介素6根据来源不同是分子量从21到28kDa不同的单链蛋白。白介素6在多种细胞中都有表达，如T细胞




、巨噬细胞、纤维原细胞




、肝细胞
、血管内皮细胞等

。由于IL-6具有不同的活性，所以IL-6也被称为干扰素β2(IFN-β2)

、B细胞刺激因子-2(BSF-2)、杂交瘤细胞生长因子
、肝细胞刺激因子
、毒性T细胞分化因子、巨噬细胞粒细胞诱导因子(MGI-2A)。白细胞介素6在B-细胞向Ig分泌细胞的转化过程起到重要的作用，参与了淋巴细胞和单核细胞的分化









，诱导神经细胞在B-细胞，T-细胞，肝细胞，造血干细胞以及中枢神经系统的分化作用




。此外

，肌肉运动收缩作用后白细胞介素6会被释放到血液中




，进而能促进脂肪的分解并改善机体的胰岛素耐受性




。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-6的浓度。IL-6捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的IL-6会与捕获抗体结合
，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。当加入生物素化的抗猪IL-6抗体后



，抗猪IL-6抗体与IL-6接合
，形成夹心的免疫复合物




，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素





。生物素与亲合素特异性结合

，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来


；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去

。最后加入显色剂，若样本中存在IL-6将会形成免疫复合物
，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测


，读其450nm处的OD值，IL-6浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线
，对照未知样本中OD值

，即可算出标本中IL-6浓度
。

猪IL-6定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作
；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后
，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集
；

D.若待测样本不能及时检测
，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂
；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除
。

4.请勿使用溶血



，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确


。

注
：猪血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测
。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃
。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶


，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃





。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时
，请及时更换枪头





，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份
。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要
，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应

，请严格控制在25-28℃。

9.洗涤过程是至关重要的

，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大
。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时

，检测抗体的孵育时间应适当延长

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟


；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存





。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.如有5x标准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4份水)



。

4.标准品: 按标签复溶体积加入pH8.4的1%BSA/PBS缓冲液使IL-6终浓度达到8000pg/ml
，室温反应，请严格控制在25～28℃


，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解
，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中
。（标准曲线取七个点

，最高浓度为8000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或猪工洗板
：每孔洗涤液为300ul


，注入与吸出间隔15-30秒



。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干
。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机；                     

4.去离子水或双蒸水
；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数




，取出所需板条放置在框架内

，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封
，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔
，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液

。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔
，室温（25-28℃）孵育120分钟
。对于血清或血浆标本
，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本

，如稀释量大
，请将样本与样本分析缓冲液等量加入
，不足部分用标准品稀释液补充至100ul







。      

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干



。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)
。用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育60分钟

。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干

。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟
。   

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干
。

9.加入显色剂TMB100ul/孔

，避光室温（25-28℃）孵育20分钟




。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值


。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效

，复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值
。

3.手工绘制标准曲线
。以标准品浓度作横坐标
，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点

。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度

。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

猪IL-6参考标准曲线

注意

：本图仅供参考

，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量






。

灵敏度
，特异性和重复性:

1.灵敏度
：多次重复结果表明

，最小检出量为114pg/ml
。

2.特异性：与人、小鼠、大鼠的IL－6均无交叉反应性。

3.重复性：板内
，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Muller-Newen, G. (2003) Sci. STKE 2003:PE40.

2. Rose-John, S. et al. (2006) J. Leukoc. Biol. 80:227.

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4. Hodge, D.R. et al. (2005) Eur. J. Cancer 41:2502.

5. Jung, H.C. et al. (1995) J. Clin. Invest. 95:55.

6. Jones, S.A. (2005) J. Immunol. 175:3468.

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8. Naugler, W.E. and M. Karin (2008) Trends Mol. Med. 14:109.

9. Alberti, L. et al. (2005) Cancer Res. 65:2.

10. Schuett, H. et al. (2009) Thromb. Haemost. 102:215.