小鼠伽马干扰素定量分析酶联免疫检测试剂盒（高敏）

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测小鼠血清

、血浆或细胞培养上清液中的IFN-γ浓度

。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整,

。如有产品包装破损或质量投拆
，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏。

IFN-γ简介


：

被称为II型干扰素的IFN-γ

，是由143个残基构成的，有20和25kDa亚型的糖蛋白




，以头尾相连的同型糖蛋白的形式存在

。

IFN-γ由T淋巴细胞和NK细胞产生，用以抗病毒和干扰增殖，此外

，IFN-γ还有与免疫调节相关的几种功能包括调节细胞的增殖和程序性死亡
，刺激或抑制不同基因的表达

。

IFN-γ能通过诱导产生吲哚胺2
，3-双加氧酶来抗弓形虫和衣原体的感染
。IFN-γ是效应强烈的单核吞噬细胞增强剂
，IFN-γ是通过增强单核吞噬细胞的Mac-1的表达来达到增强胞饮作用和吞噬作用的

。IFN-γ通过增加巨噬细胞的氧自由基和TNF-α的释放来达到增强杀肿瘤细胞的作用

。IFN-γ选择性地提高包括因LPS刺激的B细胞的IgG2a和因2型T细胞呈递抗原而引起的B细胞的IgG3的释放量

。有报道称IFN-γ能引起细胞的自分泌IFN-γ作用的增强
。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中小鼠IFN-γ的浓度。小鼠IFN-γ捕获抗体已预包被于酶标板上

，当加入标本或参考品时
，其中的小鼠IFN-γ会与捕获抗体结合
，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗小鼠IFN-γ抗体后

，抗小鼠IFN-γ抗体与小鼠IFN-γ接合
，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素
。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在IFN-γ将会形成免疫复合物



，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色


。通过酶标仪检测




，读其450nm处的OD值

，小鼠IFN-γ浓度与OD₄₅₀值之间呈正比
，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值
，即可算出标本中小鼠IFN-γ浓度。

小鼠IFN-γ定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作
；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可
；

B.血清标本应是自然凝固后
，取上清，避免在冰箱中凝固血液

；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集

D.若待测样本不能及时检测

，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融
。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂

；

3.标本应清澈透明



，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除
。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测
，否则结果将不准确
。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃


。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶
，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液
。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃

。

4.底物请勿接触氧化剂和金属

。

5.加样时

，请及时更换枪头


，避免交叉污染
。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要
，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生
。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长
。

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存
。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.如有5X标准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)

。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使IFN-γ终浓度达到400pg/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置15~20分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解
，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中

。（标准曲线取七个点
，最高浓度为400 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul


，注入与吸出间隔15-30秒
。洗板5次


。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干

。

实验过程需自备的材料

：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机；                     

4.去离子水或双蒸水；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内



，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃

。

2.建议设置本底较正孔


，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液



。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线


。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中
，用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育120分钟
。4.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干



。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)




。用封板胶纸封住反应孔
，室温（25-28℃）孵育60分钟
。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)
。用封板胶纸封住反应孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟
。

8.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟

。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值

。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值

。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值
。

3.手工绘制标准曲线



。以标准品浓度作横坐标

，OD值作纵坐标


，以平滑线连接各标准品的坐标点
。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度
。

4.若标本OD值高于标准曲线上限


，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数

。

典型数值和参考曲线

小鼠IFN-γ参考标准曲线

注意：本图仅供参考
，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量








。

灵敏度


，特异性和重复性:

1.灵敏度

：多次重复结果表明
，最小检出量为1.8pg/ml。

2.特异性：与人IFN-γ和大鼠IFN-γ没有交叉反应。

3.重复性

：板内
，板间变异系数均<10%.

参考文献:

 uziel and Greene, 1990  J. Invest. Dermatol., 94:275

 Parkinson et al., 1988  J.  Immunol. Methods, 15:105